Proteomics

• Welches ist die am besten geeignete Analysemethode für die Isolierung und Analyse von Proteinen und Peptiden aus Ihren Zellkulturen, Geweben oder Bioflüssigkeiten?
• Wie können die gewünschten Proteine angereichert oder gereinigt werden?
• Welche Technologie sollte für den Verdau, die Auftrennung (gegebenenfalls einschließlich Fraktionierung) und die massenspektrometrische (MS) Analyse Ihrer Proben verwendet werden?
• Welches ist die beste Methode zur Quantifizierung der Proteine in Ihrer Probe: Multiplexing mittels Tandem Mass Tags (TMT), metabolische Markierung mittels stabiler Isotope (SILAC), offenes Profiling mittels Data-independent Acquisition (DIA) oder „Label-free“ Quantifizierung (LFQ)?

Proteomanalysen werden in der Regel mit Nano-Flüssigkeitschromatographiesystemen und massenspektrometrischer Detektion mit Flugzeit- (ToF) oder Orbitrap-Massenspektrometern durchgeführt, je nach Art der Studie, der Komplexität der Proben und den gewünschten Quantifizierungs- und Identifizierungsparametern. Für diese Projekte verfügt die Einrichtung über hochmoderne Massenspektrometer mit Ionenmobilitätstrennung (Bruker tims-ToF Pro, Thermo Orbitrap Exploris 480 mit FAIMS).

Zusätzlich zu den LC-MS-basierten Analysen bietet die Core Facility Proteomics Technologien für die Einzelzellproteomik (Fluidigm CyToF Helios (in Zusammenarbeit mit CF Flow Cytometry)) und die räumliche Proteomik (Bruker Rapiflex für MALDI-Imaging MS und Fluidigm Hyperion für Laserablation ICP-MS, in Zusammenarbeit mit CF Imaging).

Die besondere Herausforderung von Proteomics-Experimenten ist die meist individuelle Fragestellung und die höhere Komplexität des Proteoms (Isoformen, Post-translationale Modifikationen), sowie die Tatsache, dass für Proteine keine Amplifikationsmethode zur Verfügung steht. Die analytische Erfassungsgrenze wird somit einerseits von der Performance der Geräte und andererseits vom dynamischen Bereich der biologischen Probe und deren Matrix bestimmt. Eine bestmögliche Probenvorbereitung und Design des Experiments ist daher entscheidend für die erfolgreiche Durchführung.

Wenn Sie interessiert sind, Proteomanalysen in Ihrem Forschungsprojekt zu integrieren, nehmen Sie daher bitte frühzeitig Kontakt mit der Proteomics Unit auf, um das Projekt entsprechend zu planen.

Dienstleistungen

• Protein-Identifikation und Protein-Charakterisierung
  kann in unterschiedlichsten biologischen Materialien angewendet werden (Zell-Lysat, ausgeschnittene Gel-Bande, Körperflüssigkeiten, Immun-Präzipitat, biologische Fraktion, Gewebe-Probe etc.). Je nach Komplexität der Probe (einige wenige Proteine versus ganzes Proteom) und Fragestellung (globale Auflistung von enthaltenen Proteinen versus gezielte Identifikation von Ziel-Proteinen) werden unterschiedliche Methoden der Probenvorbereitung (Lyse, enzymatischer Verdau, Clean-up etc.), Trennung (Chromatographie mit unterschiedlichen Trennsäulen, Länge, Gradienten etc.) und Massenspektrometrie etabliert und angewendet. Die Parameter der MS-Analyse können angepasst werden, um z.B. post-translationale Modifikationen von Proteinen zu berücksichtigen.

• Protein-Quantifizierung
  – TMT: Multiplexing mittels Tandem Mass Tags erlaubt eine hochpräzise Quantifizierung von bis zu 18 Proben gleichzeitig in einer Multiplex-Analyse. Das Messprinzip beruht auf isobaren Markierungsreagenzien, die auf Peptidebene für ein einheitliches Signal aller Proben sorgen, nach Fragmentierung aber die Quantifizierung der einzelnen Proben erlauben. Um die Abdeckung des Proteoms zu erhöhen (mehr identifizierte und quantifizierte Proteine) kann die Probe zusätzlich offline fraktioniert werden. Aus Zellkulturen können mit dieser Methode typischerweise zwischen 6.000 und 10.000 Proteine simultan quantifiziert werden. Für Studien mit mehr als 18 Proben können mehrere Runs mittels interner gepoolter Standards kombiniert werden.
  – SILAC: Die metabolische Markierung mittels stabiler Isotope erlaubt eine Markierung von Proteinen in vivo (z.B. durch das Zellkulturmedium) und anschließend eine Verfolgung der Signale in der Massenspektrometrie. Die Methode eignet sich zur Quantifizierung neu-synthetisierter Proteine (Pulse-Chase) oder der Zuordnung zu unterschiedlichen Zellen (Source-Tracking).
  – DIA: Data-independent Acquisition bezeichnet eine Methode zum quantitativen Profiling von biologischen Proben. Bei dieser Methode wird meist vorab eine Spectral-Library durch intensive Charakterisierung der im Fokus stehenden biologischen Probe erstellt. Diese Library wird anschließend verwendet, um Massesignale zuzuordnen. Diese Methode verbindet die Vorteile der label-freien Quantifizierung mit der guten Abdeckung des Proteoms und der geringen Zahl an Missing Values, wie sie üblicherweise nur mit Multiplex-Methoden erreicht werden können.
  – LFQ: Label-free Quantification ist der Standard-Modus der quantitativen Massenspektrometrie. Bei der LFQ werden Proben separat im sogenannten Data-Dependent Acquisition (DDA) Modus gemessen und anschließend werden die Chromatogramme und Masse-Signale miteinander verglichen. Die Herausforderung dabei ist, möglichst vollständige Datenprofile zu erhalten. Diese Methode kommt ohne kostenintensive isotopendotierte Markierungs-Reagenzien aus und bietet eine hohe Flexibilität für Studien mit offener Probenzahl.

• Spatial und Single-Cell Proteomics
  Neueste Entwicklungen im Proteomics-Bereich erlauben immer sensitivere und genauere Identifizierung und Quantifizierung von Massesignalen. Mittels MALDI-Imaging können Bilddaten des Proteoms auf Gewebeschnitten generiert werden. Durch die CyTOF-Technologie ist eine zielgerichtete Analyse von Proteinen mittels Metall-markierter Antikörper auf Einzelzell-Niveau möglich.

• Proben-Vorbereitung und Methodenentwicklung
  Je nach Fragestellung reicht der Projekt-Aufwand von der Anwendung von Standard-Protokollen über die Adaptierung von solchen bis zur Entwicklung neuer Methoden. Meist sind Anreicherungen/Abreicherungen bzw. Anpassungen der enzymatischen Verdau-Bedingungen notwendig. Die Wahl eines geeigneten Lyse-Puffers ist absolut kritisch für die erfolgreiche Solubilisierung der im Fokus befindlichen Proteine – werden die Proteine nicht verlässlich in Lösung gebracht, ist eine Detektion nicht möglich. Die Probenvorbereitung stellt daher einen zentralen Bestandteil von Proteomics-Projekten dar.