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Proteomics

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Instrumentelle Analyse von Proteinen und Peptiden

Die Proteomics Core Facility berät und unterstützt Forscherinnen und Forscher an der Medizinischen Universität Wien bei der Planung und Durchführung von Experimenten, bei denen eine Proteinanalytik notwendig ist. 

Massenspektrometrie ist die Schlüsseltechnologie, welche die Proteomics Core Facility anwendet, um Proteine aus komplexen Proben zu identifizieren und zu charakterisieren. Sowohl qualitative als auch quantitative Methoden werden verwendet und neu entwickelt, damit optimale Ergebnisse erzielt werden können. In den meisten Fällen wird die die „bottom-up“ Methode verwendet, bei der Proteine enzymatisch verdaut und die entstehenden Peptide mittels nano-HPLC vor der Detektion getrennt werden. 

Da das Messergebnis auch wesentlich von der Datenbanksuche abhängt, verwendet die Proteomics Core Facility Software der neuesten Generation. Die Datenbanksuche wird immer mit der neusten Version der entsprechend Datenbank durchgeführt. Mascot und X!Tandem sind die bei uns am häufigsten eingesetzten Suchmaschinen.

Dienstleistungen

  • Molekulargewichtbestimmung von Proteinen
    Molekulargewichtsbestimmung für gereinigte Proteine und Peptide mittels HPLC-ESI-MS/MS. Die HPLC Trennung wird (nach Bedarf) entweder auf einer Mikro- oder auf einer Nanotrennsäule durchgeführt und die Detektion findet mittels q-ToF Massenspektrometer (Quandrupol Time-of Flight) statt.
    Durch die chromatographische Trennung der Analyte auf der HPLC- Säule findet eine zusätzliche Probenreinigung statt und interferierende Verunreingungen werden vom Analyten getrennt.
  • Tandem – MS Proteinidentifikation
    Die Proteinidentifikation erfolgt mittels automatisierter Datenbanksuche der MS – MS Spektren.
    Die Proteomics Core Facility der Medizinischen Universität Wien verwendet verschiedene Massenspektrometer (maXis Impact qToF  LTQ Velos, Amazon Speed ETD), um möglichst breite Anwendungsgebiete für Peptide und Proteine abzudecken.
    Im Fall der qualitativen Analyse der Spots aus den 2D Gelen werden kurze HPLC Gradienten (30 Minuten) verwendet und Data - Dependent MS/MS Methode. Die anschließende MASCOT Datenbanksuche von unterschiedlichen Proteindatenbanken liefert die Endergebnisse.
    Für die qualitative Analyse von 1D- Gelbanden oder von komplexeren Proben, wie zum Beispiel Zelllysaten, werden chromatographische Trennungen mittels langen und flachen Gradienten (von 60 min bis zu 10 Stunden auf 50 cm langen Nanosäulen) und Detektion am q-ToF Massenspectrometern verwendet. Die höhere Trennkapazität und bessere Trenneffizienz ermöglicht die bessere Analyse von komplexen Proben und eine bessere Proteinidentifikation.
    Für extrem komplexe Proben aus Gewebe- oder Organlysaten wird eine mehrdimensionale chromatographische Trennung vor der MS/MS Analyse gemacht. Bei allen mehrdimensionalen Verfahren ist die Peptidtrennung auf der Reversed Phase Säule die letzte Trennmethode vor der MS Detektion. Die erste Trenndimension kann unterschiedliche Trennmechanismen beinhalten: Starke Kationentauscher (SCX), Starke Anionentauscher (SAX), Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC), Size Exclusion Chromatography (SEC), oder ERLIC HPLC. Alle multidimensionalen Trennungen werden als Off-Line Trennungen ausgeführt. Das heißt, dass Fraktionen von der ersten Trennung gesammelt und danach auf die nächste Trennsäule, in der zweiten Trenndimension, wieder injiziert werden.

Anmerkung

Proteinanalytik ist nicht einfach. Die wichtigsten Gründe dafür sind:

  1. In jedem biologischen System gibt es sehr viele und sehr komplexe Proteine, welche miteinander verknüpft sind, miteinander reagieren, Komplexe bilden, posttranslational verändert werden usw. Während es in einer Zelle ungefähr 10.000 Gene gibt, kann die Transkription jedes einzelnen Gens zu hunderten unterschiedlichen Proteinen führen.
     
  2. Proteine können in biologischen Systemen sowohl in sehr hohen als auch in sehr niedrigen Mengen und Konzentration vorkommen. Zum Beispiel können im Vergleich zu den zytoskeletalen Proteinen Signalproteine bis zu millionenfach oder noch weniger vorhanden sein. Die Identifikation niederabundanter Proteine ist eine große analytische Herausforderung.
     
  3. Nicht alle Proteine in einer Probe sind für eine Quantifizierung zugänglich. Proteine können als größere Komplexe auftreten oder als Polymere, welche mit gängigen Verdauungsprotokollen nur unzureichend verdaut werden. Eine Konsequenz ist, dass nur lösliche Proteine „sichtbar“ sind, während größere Komplexe nur schlecht analysiert werden können.
    Sehr oft wird der unlösliche Teil ignoriert und diese Proteine bleiben unentdeckt. Deswegen ist die Entwicklung von besonderen Methoden notwendig.

 

Eine allgemeine Methode, die alle diese Fragen ansprechen würde, gibt es noch nicht. Der einzige Weg, alle diese Einschränkungen zu überwinden ist, sich deren bewusst zu sein und entsprechende Methoden für jeden einzelnen Probenvorbereitungsschritt zu optimieren und anzupassen.


Ap.Prof. Priv.-Doz. Dipl.-Ing. Dr. Klaus KRATOCHWILL

Leitung der CF Proteomics

T: +43 (0)1 40400-73747
klaus.kratochwill@meduniwien.ac.at